师：同学们，今天我们继续学习高二人教版生物学选择性必修三第一章第二节微生物的培养技术及应用第四课时。上节课我们学习了利用选择培养基分离特定种类的微生物，以及统计微生物数量方法的理论知识。下面结合课本18页探究实践“土壤中分解尿素的细菌的分离和计数”这一课题，来学习具体的实践操作。
这项课题需要解决两个问题：第一，土壤中含有能分解尿素的细菌，如何分离它们？第二，每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌？该怎样设计实验来分离分解尿素的细菌并统计它们的数量呢？请根据前面学过的微生物选择培养、数量测定的知识，设计土壤中分解尿素细菌的分离和计数的探究方案。接下来请阅读课本19页3则资料，对设计的方案进行修正。
为了对分解尿素的细菌进行选择性培养和统计其数目，实验设计方案如下：第一，制备培养基；第二，取样；第三，样品的稀释和涂布平板；第四，微生物的培养和观察；第五，菌落的计数。其中3和4是对细菌进行选择培养。在设计实验方案时，怎么知道选择培养基是否具有选择作用？又怎么知道做实验用的培养基是否被污染了呢？可以通过设计对照实验来验证选择培养基是否具有选择作用。具体做法是：设置涂布稀释液的牛肉膏蛋白胨培养基作为对照组，涂布稀释液的以尿素作为唯一氮源的选择性培养基作为实验组，通过比较两组的实验结果来验证选择培养基是否具有选择作用。另外，可以分别设置不涂布稀释液的以尿素作为唯一氮源的选择性培养基和牛肉膏蛋白胨培养基，根据两个培养基的实验结果来验证培养基是否被污染。下面是具体的操作过程。
第一，制备培养基，需要配置两种培养基。第一种是以尿素作为唯一氮源的选择培养基，主要用来分离分解尿素的细菌；第二种是牛肉膏蛋白胨培养基，用来设计对照组实验。第二，取样。第一，取样地点要求酸碱度接近中性、潮湿且富含尿素的土壤；第二，取样部位为距地表3厘米左右的表层土，因为细菌绝大部分分布在距地表3 - 8厘米的土壤层。在城市，常见的取样地点是公园里、街道旁花盆中的土壤；在农村，则容易收集到农田或者菜园里的土壤。第三，样品的稀释与涂布平板。下面请大家思考与讨论以下3个问题。
先看第一个问题：分离土壤中不同的微生物采用的稀释范围相同吗？测定土壤中细菌的总量和测定能分解尿素的细菌的数量，哪个稀释度高？不同微生物在土壤中含量不同，分离不同的微生物需采用不同的稀释度，以保证获得菌落数在30 - 300之间、适于计数的平板。测定平板中细菌的总量时稀释度更高，因为细菌总数量高于能分解尿素的细菌数量。细菌数一般用10?、10?、10?稀释液；测放线菌数一般用103、10?、10?稀释液；测真菌数一般用102、103、10?稀释液。
第二个问题：在初次实验中，若对稀释的范围没有把握，怎样做才能保证从中选择出菌落数在30 - 300的平板进行计数？如何证明已稀释成功呢？在初次实验中，若对稀释范围没把握，应选择一个较宽的范围，例如可以将1×103到1×10?倍稀释的菌液分别涂布到平板上培养，这样就能保证从中选择出菌落数在30 - 300的平板进行计数。如果得到2个或两个以上菌落数目在30 - 300的平板，说明稀释操作成功。若得到两个或两个以上菌落数目在30 - 300的平板，且同一稀释倍数的三个重复平板上菌落数相差不大，可进行菌落的计数；若菌落数相差太大，说明实验误差大，需要重新实验。
第三个问题：每个稀释度至少涂布几个平板呢？每个稀释度至少设计4个平板。其中1、2、3这三个平板以选择培养基作为实验组，且设计3个重复用来分离分解尿素的细菌；而第4个平板则以牛肉膏蛋白胨培养基作为对照组，用来判断选择培养基是否具有选择作用。此外，整个实验还要多设置两个平板，分别是不涂布稀释液的选择培养基和牛肉膏蛋白胨培养基，主要用于对照，验证两种培养基是否被杂菌污染。接下来对微生物进行培养以及观察。第一，培养条件。不同种类的微生物往往需要不同的培养温度、pH值和培养时间。细菌一般在30到37摄氏度的温度下培养1到2天。第二，观察。每隔24小时统计一次菌落的数目，选取菌落数目稳定时的记录作为实验结果。一般来说，在相同的培养条件下，同种微生物表现出稳定的菌落特征，比如形状、大小、颜色、透明度、光泽度和隆起程度等等。最后对菌落进行计数，当菌落数目稳定时，选取菌落数在30 - 300的平板进行计数。同一稀释度下至少计数3个平板，求出平均值，并根据所对应的稀释度计算出样品中的细菌数目。那应该如何设计实验结果记录表来表示结果呢？请大家尝试设计。
为保证实验顺利进行，还要注意以下操作：第一，将涂布器从酒精中取出，要让多余的酒精在烧杯中滴尽，然后再放在火焰上灼烧。不要将过热的涂布器放在盛有酒精的烧杯中，以免引起酒精燃烧。第二，实验全程注意无菌操作。首先，取土样时用的铁铲和取土袋在使用前都需要灭菌，操作完成后一定要洗手；其次，应在火焰旁称取土壤，在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞；最后，在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行操作。第三，做好标记。本实验使用的平板和试管较多，为避免混淆，最好在使用前做好标记。例如在标记培养皿时应注明组别、培养日期和平板上培养样品的稀释度等。第四，制定计划。对于耗时较长的生物实验，要事先规划好时间，以便提高工作效率，操作时更加有条不紊。