师：同学们，大家好，今天我们来学习高二人教版生物学选择性必修三第一章第二节微生物培养技术及应用第二课时。上节课我们掌握了培养基的配置和无菌技术，今天我们继续学习第三项技术——微生物的纯培养。关于微生物的纯培养，我们首先要掌握三个相近的基本概念。
师：首先是培养物，培养物是指接种于培养基内，在合适条件下形成的含特定种类微生物的群体。而纯培养物则是指由单一个体繁殖所获得的微生物群体，也就是说这一群体内的所有个体均是同一种微生物。获得纯培养物的过程就是纯培养。
师：微生物的纯培养包括配置培养基、灭菌、接种、分离和培养等步骤。那如何才能实现微生物的纯培养，获得纯培养物呢？首先我们要了解一个概念，菌落是指分散的微生物在适宜的培养基表面或内部可以繁殖形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体。由一个细胞繁殖而来的菌落中所有的个体均为同一种微生物，所以我们可以将单个微生物分散在固体培养基上，经过培养得到的单菌落一般就是由单个微生物繁殖形成的培养物。基于这一原理，我们就可以获得纯培养物了。
师：将菌液中的微生物在固体培养基表面分散成单个细胞的常用接种方法有两种，分别是平板划线法和稀释涂布平板法。我们这节课先来掌握平板划线法，稀释涂布平板法则在下节课介绍。
师：下面我们以酵母菌的纯培养为例，通过实际操作来学习微生物的纯培养技术。第一步是制备培养基。适宜培养酵母菌的是马铃薯琼脂培养基，所以我们首先要制备这一培养基。称取去皮的马铃薯200克切成小块，加水1000毫升，加热煮沸至马铃薯软烂，用纱布过滤。向滤液中加入20克葡萄糖（也可用蔗糖代替），并加入15 - 20克琼脂，用蒸馏水定容至1000毫升。
师：接着就要进行灭菌，除了刚刚配置好的培养基以外，用来盛放培养基的培养皿也要进行灭菌。那培养基和培养皿应该分别用什么方法来进行灭菌呢？对于培养基，我们可以采用高压蒸汽灭菌。将配置好的培养基转移至锥形瓶中，加棉塞，包上牛皮纸，并用皮筋勒紧，再放入高压蒸汽灭菌锅中，在压力为100千帕，温度为121摄氏度的条件下灭菌15 - 30分钟。而对于培养皿，我们则可以用干热灭菌。将5 - 8套培养皿包成一包，用几层牛皮纸包紧，放入干热灭菌箱内，在160 - 170摄氏度灭菌两小时。
师：接着就是要把培养基倒入培养皿内，我们将这一步骤称为倒平板。我们要等待培养基冷却至50摄氏度左右才能倒平板，并且全程要在酒精灯火焰附近进行。那为什么要等培养基冷却到50摄氏度左右才能倒平板呢？因为如果在温度较高时倒平板，形成的水蒸气就会很多，水蒸气会凝结在培养皿盖上，容易倒流，污染培养基。温度过低也不行，因为琼脂一般会在45摄氏度时凝固，所以当温度过低时，培养基就会凝固，无法倒出。即使能够倒出，培养基也会有结块，导致表面不光滑。
师：那为什么又要在酒精灯火焰附近倒平板呢？因为倒平板时培养基会接触到周围的空气，容易混入杂菌，而酒精灯火焰周围温度很高，微生物很少，甚至没有，这样就可以避免外来微生物的污染了。那倒平板的具体操作又是如何呢？接下来我们一起来看倒平板操作的演示视频，留意每一步是如何操作的，并且思考为什么要这样操作。看完之后，我们再来尝试描述倒平板的完整过程。
（播放倒平板操作演示视频）
师：点燃酒精灯，在酒精灯火焰旁边打开锥形瓶封口膜。右手加持封口膜和锥形瓶，左手持培养皿，往培养皿内倒入20毫升左右培养基，在超净台上轻轻摇匀后冷却，冷却后倒置备用。
师：下面我们来归纳一下倒平板的操作步骤。第一步，首先要拔出装有培养基的锥形瓶的棉塞，用无名指和小指将棉塞拽于手心，切勿直接将棉塞放于桌面上，因为桌面上可能存在微生物，放在桌面上的棉塞可能会带上微生物，当重新塞上棉塞时，有可能会将杂菌混入培养基。打开棉塞后，将锥形瓶的瓶口迅速通过火焰。为什么要进行这一步操作呢？因为锥形瓶的瓶口可能会附着有微生物，所以我们可以通过灼烧灭菌的方式杀灭瓶口上的微生物，防止瓶口的微生物污染培养基。
师：接着我们在酒精灯火焰附近用中指、无名指和小指拖住培养皿的皿底，用拇指和食指将培养皿打开一条稍大于瓶口的缝隙，将10 - 20毫升的培养基倒入培养皿内，然后立即盖上皿盖。这个操作对于初学者来说比较繁琐，对操作者的手指灵活度有一定要求。那为什么不能直接完全打开皿盖再倒入培养基呢？因为如果直接打开皿盖的话，周围空气中的微生物就有可能直接落入培养基中，所以为了避免杂菌污染培养基，在操作时切勿完全打开皿盖倒入培养基。盖上皿盖后，可以轻轻晃动培养皿，让培养基铺满整个培养皿的皿底。倒完平板后，再次将锥形瓶的瓶口通过火焰，并将掌心中的棉塞塞入锥形瓶中，等待培养基冷却凝固后，就要将培养皿倒过来放置。那为什么要倒置平板呢？因为平板凝固后，水蒸气会在皿盖上凝结，形成水珠。此外，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置既可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。
师：在制备培养基之后就要进行接种和分离酵母菌，这里我们用的接种方法是平板划线法。平板划线法是指通过接种环在固体培养基表面连续划线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养基的表面，经数次划线后培养可以分离得到单菌落。那平板划线是如何实现逐步稀释分散菌种的呢？具体操作步骤又是如何的呢？下面我们一起来观看平板划线操作的视频，思考每个步骤的目的，归纳平板划线的流程，并尝试简单分析一下平板划线逐步稀释分散菌种的原理。
（播放平板划线操作视频）
师：取大肠杆菌斜面一支，灼烧接种环，在斜面试管内稍稍冷却。用接种环轻轻刮出一圈菌体，将菌体划线接种到固体培养基上。划线时先在培养皿的一个局域内划线，然后转动培养皿90度，将接种环上残留的菌体烧灼，完全冷却后，接着第一次划的线后端交错划线，如此重复操作4次。划线过程中要注意仅手腕轻轻抖动即可，不要用力将培养皿划破。总共划3个平板和一个空白对照。
师：我们首先来分析一下平板划线逐步稀释分散菌种的原理。在进行平板划线时，接种环只蘸取一次菌液，但是却在培养基的不同区域连续多次划线，通过这个操作就可以实现逐步稀释分散菌种的目的。那具体是要在哪些区域如何划线呢？回忆刚刚播放的操作视频，在视频中首先是在培养基表面画3 - 5条平行线，这是第一次划线区域，然后进行第二次划线，第二次划线要从第一次划线的末端开始，同样画3 - 5条平行线，这是第二次划线区域。那为什么要从上一次划线的末端开始划线呢？相信同学们也有过类似的生活体验，当菌液量一定时，划线末端所含的细菌数目会比前端要少。每一次划线都从上一次划线的末端开始，就能够使细菌的数目随着划线次数的增加而逐渐减少。一般要进行3 - 5次划线，即还要划第三区域、第四区域还有第五区域，才能把菌液分散成单个菌落。
师：在进行最后一个区域的划线时，注意不要将其与第一次的划线相连，因为最后一次划线已经将细菌稀释成单个细胞，而第一次划线中的细菌数量较多，如果最后一次划线与第一次划线相连，就会增加了细菌的数目，达不到纯化的效果。平板划线稀释微生物的原理我们已经了解了，接下来我们来归纳一下平板划线的操作流程，并分析每一步的作用或目的。