师：同学们，现在我们开始高二人教版生物学选择性必修三第三章基因工程的基本操作程序第二课时的学习。首先，回顾一下上节课内容，我们学习了如何获取转基因抗虫棉，来回顾其基本流程及主要步骤。第一步，筛选和获取BT基因，这是基因工程中目的基因的筛选与获取；第二步，获取质粒、噬菌体等载体，用限制酶切割载体和含BT基因的DNA片段，再用DNA连接酶连接构建基因表达载体；第三步，将含有BT基因的表达载体导入受体细胞；第四步，检测和鉴定BT基因是否稳定维持和表达其遗传特性。
学习了转基因抗虫棉的获取步骤，我们能不能设计一个获取转基因产品的方案呢？这里给大家两个资料：资料一，番茄是基础生物学研究的重要对象和模式植物，但番茄不耐寒，生长最适低温是20 - 23度，当低温降到6度时，根系停止生长。资料二，栖息于南极和北极的极地鱼类，能长期在零下低温环境中生存，也称为抗冻鱼。经研究发现，抗冻鱼血液中含有抗冻蛋白AFP，对冰晶具有较高亲和力，能够附着到冰晶表面，阻止冰晶长大，所以抗冻鱼能在低于血浆冰点的温度下生存且血浆不凝固，达到抗冻效果。目前科学家不仅掌握了抗冻蛋白基因AFP的序列信息，也对抗冻蛋白AFP有了较为深入的了解。请根据资料，参考转基因抗虫棉获取的主要步骤，设计获取转基因抗冻番茄的方案。下面，老师带领大家一起来设计方案。
和转基因抗虫棉一样，第一步是目的基因的筛选与获取。上节课讲过，从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选目的基因是较为有效的方法之一。我们对抗冻蛋白基因AFP已有较深入了解，所以选用抗冻蛋白基因AFP作为目的基因。我们可以从基因文库中获取抗冻蛋白基因AFP，也可以人工合成，还能利用PCR获取。
获取目的基因之后，还要对其进行扩增，用什么方法呢？利用PCR扩增抗冻蛋白基因AFP。PCR是如何扩增目的基因的？我们来学习一下PCR技术的相关内容。PCR技术是1985年穆利斯等人发明的，为此，1993年穆利斯获得诺贝尔化学奖。在PCR技术中，我国台湾科学家钱嘉韵也做出了重要贡献。PCR全称聚合酶链式反应，是在生物体外提供参与DNA复制的各种组份与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术，利用的是DNA半保留复制的原理。
我们先回顾体内DNA复制所需要的基本条件：体内解旋酶断裂氢键打开DNA双链，打开的DNA母链提供DNA复制模板，需要4种脱氧核苷酸作为合成DNA子链的原料，DNA聚合酶催化合成DNA子链，DNA复制还需要引物，引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸，使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核苷酸。而PCR技术是在生物体外利用DNA热变性的原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。所以，体外用高温代替解旋酶打开DNA双链，那么体外催化合成DNA子链的DNA聚合酶就需要能耐高温。我国台湾科学家钱嘉韵就是第一个发现和分离耐高温DNA聚合酶的人，所以历史不能忘记中国科学家对PCR的贡献。据分析，PCR技术需要的条件包括DNA模板，即含目的基因的DNA分子、两种引物、4种脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶。用于PCR的引物，长度通常为20 - 30个核苷酸。具体的扩增过程如下：当温度升高到90度以上时，双链DNA解聚为单链，我们称之为变性；当温度下降到50度左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，即复性；当温度上升到72度左右时，溶液中的四种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链，这个过程我们称之为延伸。
至此第一轮循环结束，得到两个DNA分子。第一轮循环的产物作为第二轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第二轮循环的产物，得到4个DNA分子。第二轮循环的产物作为第三轮反应的模板，经过变性、复性和延伸三步产生第三轮循环的产物，得到8个DNA分子。
我们对扩增过程做个小结：PCR就是温度升高到90度以上，让目的基因DNA受热后解聚为单链，再下降到50度左右复性，使两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，再上升到72度左右，以单链DNA为模板，在耐高温DNA聚合酶的作用下进行延伸，即将四种脱氧核苷酸加到引物的3'端，然后重复循环变性、复性、延伸。通过重复循环，最终一个模板DNA分子经过n轮PCR以指数方式扩增，可以扩增出2的n次方个DNA片段。所有这些过程可以在PCR扩增仪中自动完成。以后常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物。
我们来看一道PCR相关的题：利用PCR既可以快速扩增特定基因，也可以检测基因的表达。下列有关PCR的叙述错误的是（ ）A. PCR用的DNA聚合酶是一种耐高温酶；B. 过程中双链DNA的解开不需要解旋酶；C. 复性中引物与模板链的结合遵循碱基互补配对原则；D. 延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP和4种核糖核苷酸。答案是D，延伸过程中需要耐高温DNA聚合酶、4种脱氧核苷酸。
目的基因筛选与获取后，我们要构建基因表达载体，这一步是转基因抗冻番茄的核心工作。我们先回顾一下基因表达载体的组成，如图所示，基因表达载体包括限制酶切割位点，要插入需要转入的目的基因；复制原点是DNA分子复制起始的地方；标记基因用来鉴定和筛选含有目的基因的受体细胞；启动子是一段有特殊序列结构的DNA片段，是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动转录；终止子也是一段有特殊序列结构的DNA片段，终止转录。基因表达载体中有启动子、终止子，它们的来源是什么呢？如果目的基因是从自然界中已有的物种中分离出来的，已含有启动子、终止子，在构建基因表达载体时，不需要在质粒上接上特定的启动子、终止子。如果目的基因是通过人工方法合成的或是cDNA，则目的基因不含启动子和终止子。因此，在构建基因表达载体时，需要在目的基因的前后端接上特定的启动子、终止子。