师：同学们，现在开始上课，今天我们学习高二人教版生物学选择性必修三第三章基因工程第一节重组 DNA 技术的基本工具第一课时。大家看这幅图，很多同学第一反应会觉得这是棉花，其实这不是棉花的花，而是棉花的果实。这两幅图展示的才是真正的棉花的花。棉花结果后形成棉铃，棉铃成熟吐絮，才形成我们熟悉的棉花。我国是棉花生产和消费大国，但棉花种植过程中常受棉铃虫侵袭，导致大量减产。大量施用农药，不仅增加生产成本，还可能造成农产品和环境污染。如果能培育出自身抗虫害的棉花新品种，就能解决这些问题。
我们知道棉花本身没有抗虫基因，而科学家发现苏云金杆菌有一种抗虫基因，能表达出抗虫蛋白杀死棉铃虫。那能否将苏云金杆菌的抗虫基因导入棉花细胞呢？这个设想如今已通过基因工程实现。我们先来了解什么是基因工程。基因工程是指按照人们的意愿，通过转基因等技术赋予生物新的遗传特性，创造出更符合需求的新生物类型和生物产品。从技术操作层面看，基因工程是在 DNA 分子水平上设计施工的，所以又叫做重组 DNA 技术。我们用表格从水平、原理、技术、结果四个方面梳理一下：基因工程在 DNA 分子水平操作，利用基因重组原理，又叫重组 DNA 技术或转基因技术，最终产生新生物类型和新生物产品。
这节课是基因工程的基础，我们先学习重组 DNA 技术的基本工具。培育转基因生物至少需要三种分子工具：第一种是精准切割 DNA 分子的“分子手术刀”——限制性内切核酸酶，简称限制酶；第二种是能将 DNA 片段拼接在一起的“分子缝合针”——DNA 连接酶；还有“分子运输车”——基因进入受体细胞的载体。
我们先来了解限制酶，它主要从原核生物中分离纯化出来，作用是识别双链 DNA 分子的特定核苷酸序列，并使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。回顾必修知识，一分子五碳糖、一分子含氮碱基和一分子磷酸形成核苷酸。看五碳糖的 2 号碳上没有羟基，可确定是脱氧核糖，这是一个胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸，是 DNA 分子的基本组成单位。下面这个是胞嘧啶脱氧核糖核苷酸，通过脱水缩合，上一个核苷酸 3 号碳上的羟基与下一个核苷酸 5 号碳上的磷酸反应形成酯基。图中蓝圈显示的就是磷酸二酯键，而限制酶断裂的是两个相邻核苷酸之间的磷酸二酯键，也就是图上红杠显示的位置。请大家在课本图 3 - 2 的相应位置，用红笔标示清楚限制酶的作用部位，要注意 DNA 两条链是反向平行的。再次强调，限制酶的作用是识别双链 DNA 分子的特定核苷酸序列，并使每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开，这体现了酶的专一性。
接下来看两个实例，EcoRⅠ和 SmaⅠ限制酶。很多同学对限制酶的命名感兴趣，这里给大家介绍一下限制酶名字的由来。以 EcoRⅠ限制酶为例，Eco 是大肠杆菌属名和种名的缩写，r 代表菌株品系，Ⅰ表示是在大肠杆菌 r 型菌株中分离出来的第一种限制性酶。SmaⅠ的命名同理。下面详细讲解这两种限制性酶的作用。
大多数限制酶的识别序列由 6 个核苷酸组成，而且通常是回文序列。以 EcoRⅠ为例，它识别的是 GAATTC 序列。因为 DNA 双链反向平行，所以下面这条链从右下角的 5’端开始读，也是 GAATTC 序列，这就是回文结构。识别特定核苷酸序列 GAATTC 后，切断特定部位 G 和 A 之间的磷酸二酯键，同时由于氢键键能较弱，自动断裂，最后产生两个粘性末端。
SmaⅠ首先识别的是 CCCGGG 序列，下面这条链同样是 CCCGGG。确定序列后切断 C 和 G 之间的磷酸二酯键，产生的叫平末端。限制酶作用结果是产生粘性末端或平末端。怎么判断限制酶切割产生的是粘性末端还是平末端呢？从图中可以看到，在序列中轴线两侧进行切割产生的是粘性末端，在中轴线处切割产生的是平末端。我们看这个小动画，EcoRⅠ先识别 GAATTC 序列，然后在 G 跟 A 之间断键产生两个粘性末端。我们试着写一下这两个粘性末端，横杠表示旁边还有省略的核苷酸序列。
现在做一道选择题，下图所示的粘性末端属于同一种限制酶切割产生的是：1 的粘性末端单链是 AGCT，2 的粘性末端单链是 AATT，3 是 ACCT，4 是 AATT。显然 2 和 4 是相同的粘性末端能够互补，把 2 的末端拼到 4 上刚好吻合，所以答案选 C。
基因工程的第二个工具是 DNA 连接酶，它能催化连接两个 DNA 片段，这与我们之前学过的 DNA 聚合酶不同。DNA 聚合酶催化连接的是单个脱氧核苷酸，而 DNA 连接酶催化连接的是 DNA 片段。基因工程操作中 DNA 连接酶主要有两类，只能连接互补粘性末端的是 E·coli DNA 连接酶，顾名思义，它是从大肠杆菌中提取的；还有从 T4 噬菌体中提取的 T4 DNA 连接酶，既能连接粘性末端，又能连接平末端，但连接平末端时效率相对较低。它们的作用结果是恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键，形成新的重组 DNA 分子。
我们来练习一下，看这道题。如图为 DNA 分子的某一片段，其中圈 1、圈 2、圈 3 分别表示某种酶的作用部位。则相应的酶依次是什么？观察图可知，圈 1 是氢键，是解旋酶的作用部位；圈 2 为磷酸二酯键，是限制酶的作用部位；圈 3 是两个 DNA 片段的缺口，是 DNA 连接酶的作用部位，所以 C 选项正确，即圈 1 解旋酶、圈 2 限制酶、圈 3 DNA 连接酶。
获得苏云金杆菌的抗虫基因，也就是我们需要的目的基因后，可不可以直接导入受体细胞，即导入棉花细胞呢？答案是不能直接导入，必须借助基因工程的第三个基本工具——载体。
基因工程最常用的载体是质粒，它是一种环状 DNA 分子，裸露、结构简单，独立于真核细胞核或原核细胞拟核 DNA 之外，也就是说，它既不属于细胞核 DNA，也不属于拟核 DNA，具有自我复制能力。看图示的大肠杆菌细胞，我们能看到它的拟核以及拟核之外的质粒。放大后了解一下质粒的结构，质粒有一个至多个限制酶切割位点，供外源 DNA 片段插入其中，这里的外源 DNA 片段也就是目的基因，比如我们之前提到的抗虫基因。当质粒进入受体细胞时，作为载体携带目的基因共同进入。质粒还含有复制原点，能在受体细胞自我复制或整合到受体 DNA 上，随受体 DNA 同步复制，这样目的基因就可以大量增殖。我们还发现质粒上有个氨苄青霉素抗性基因，这是特殊的标记基因，便于重组 DNA 分子的筛选。基因工程上用到的质粒都是在天然质粒基础上进行过人工改造的。