师：同学们，我们现在学习高二人教版生物学选择性必修三第三章基因工程的基本操作程序第三课时内容。PCR 即聚合酶链式反应，是一种高效的核酸体外扩增技术，能从 DNA 混合物中选择性扩增目的基因的特定核苷酸序列，获取大量拷贝。它在生物学实验用途广泛，不仅用于基因工程基本操作程序，还应用于新冠病毒核酸检测、遗传病诊断、刑侦破案等领域。同学们，你们知道 PCR 具体是如何操作的吗？今天我们一起来学习探究实践“DN 段的扩增及电泳鉴定”。本探究实践目的要求有二：一是了解 PCR 和电泳鉴定的基本原理；二是尝试进行 PCR 的基本操作，并用琼脂糖凝胶电泳对 PCR 产物鉴定。
上一课时我们知道 PCR 技术利用了 DNA 半保留复制原理，那它还利用了什么原理呢？我们回顾下 PCR 反应过程。PCR 每次循环一般分三个步骤：超过 90 度时，DNA 双链解旋为单链；50 度左右复性，引物与两条单链 DNA 模板结合；72 度延伸，以 DNA 单链为模板合成新的 DNA 链。一次 PCR 一般要经历 30 次这样的循环。由此可知，PCR 反应过程需不断调节温度控制 DNA 双链的解链与结合，所以 PCR 还利用了 DNA 的热变性原理。
PCR 操作需要的材料用具有：PCR 仪，实际上是一台能自动控温实现 DNA 扩增的仪器；微量离心管，作为 PCR 反应的场所，规格一般有总容积 0.2 毫升和 0.5 毫升两种；微量移液器，用于量取、转移液体。微量移液器包括调节旋钮、推动杆、卸载枪头按钮、体积刻度和吸液杆。不同型号量程不同，一般有 0.5 - 10 微升、20 - 200 微升、100 - 1000 微升、1000 - 5000 微升等。设定移液器吸取体积时，严禁将底基刻度调到超出量程范围，用完后需调到最大刻度。因其形状及在实验中的必要性，微量移液器通常被形象称作“枪”。使用时需安装一次性吸液枪头，每吸取一种试剂后都必须更换。
微量移液器使用步骤如下：首先利用调节旋钮进行容量设定，然后用旋转按压法安装吸液枪头，注意安装时用力不能过猛。吸液时，按压推动杆至第一停点，将吸液枪头垂直插入液面，再平稳松开。放液时，枪头紧贴容器壁，先按压推动杆至第一停点，稍作停顿后再按压至第二停点，确保吸液枪头内无液体残留。最后按压卸载枪头按钮，卸去吸液枪头。下面通过一段视频加深对移液器使用操作的认识。
以量取 80 微升液体为例，可使用 20 - 200 微升的移液器。吸取液体前，轻轻旋转调节按钮，确认方向正确后快速转动设定体积，旋转至 80 微升刻度处。然后套上枪头，用旋转按压法按压旋转，枪头即套好。吸取液体时，按压调节按钮驱动推动杆，先按压至第一停点，将枪头伸入离心管液面以下，松开大拇指吸取液体。拿出新离心管，将枪头伸入管内紧贴管壁，按压调节按钮至第一档位停点，稍作停顿后继续按压至第二档位停点，枪头内液体即完全释放，松开大拇指，液体就移到空离心管内。卸载枪头时，按压卸载枪头按钮，枪头即卸下。
PCR 反应体系中需加入哪些组份呢？我们知道 PCR 模拟了 DNA 半保留复制过程，由此推测 DNA 扩增需要的基本组分包括 DNA 模板、4 种脱氧核苷酸作原料、两种引物、DNA 聚合酶以及合适的反应条件如 pH、镁离子等。以 50 微升反应体系为例，PCR 反应体系配方如下：模板 DNA 5 - 10 微升，含 DNA 量为 1 皮克到 1 微克；20 毫摩尔每升的四种脱氧核苷酸等量混合液 1 微升；20 微摩尔每升的引物 1 和引物 2 各 2.5 微升；1 - 5 单位/微升的 Taq DNA 聚合酶（即耐高温的 DNA 聚合酶）1 - 2 单位；10 倍浓缩的含镁离子的扩增缓冲液 5 微升；最后用 28 - 33 微升无菌水补足反应体系至 50 微升。
需注意，PCR 反应体系配方中的四种脱氧核苷酸实际为 dNTP，dNTP 指四种脱氧核苷酸三磷酸，包括 dATP、dTTP、dGTP 和 dCTP。在 DNA 聚合酶催化新链合成过程中，每掺入一个脱氧核苷酸，伴随两个高能磷酸键断裂，释放的能量可满足脱氧核糖核酸聚合反应需求。下面做一道单项选择题：下列关于 PCR 的说法错误的是（ ）
A. PCR 是体外复制 DNA 的技术。
B. PCR 过程中只需要一个模板 DNA 和两种引物分子、大量脱氧核苷酸原料。
C. Taq DNA 聚合酶具有耐高温特点。
D. PCR 利用了 DNA 的热原理。
PCR 过程除需要一种模板 DNA、两种引物分子、大量脱氧核苷酸原料外，还需扩增缓冲液、Taq DNA 聚合酶等，B 项说法错误，此题答案选 B。下面看一段视频了解 PCR 的操作过程。
取一支 0.2 毫升的微量离心管配置 PCR 反应体系。首先加入 28 微升无菌水，然后按顺序依次加入 PCR 反应体系配方中的其他试剂，加入试剂时需贴管壁加入。PCR 反应体系配置完毕后需混匀，可用低速离心机进行混匀。把 PCR 管放入离心机，低速离心 30 秒，使反应液集中在管底。
打开 PCR 仪电源，将 PCR 管放置于 PCR 仪反应槽中，进入菜单设置 PCR 反应程序。按如下表设置：94 度预 5 分钟，然后重复以下三个步骤循环 30 次，94 度 30 秒，55 度复性 30 秒，72 度延伸 1 分钟。最后一次循环，94 度 1 分钟，55 度复性 30 秒，72 度延伸 1 分钟。设置完毕后启动 PCR 反应。
PCR 反应结束后，取出离心管进行 PCR 产物检测。从视频可见，PCR 操作过程一般分三步：移液，用微量移液器把 PCR 配方中各组份按顺序加入微量离心管；离心，将微量离心管放入离心机离心约 10 秒，使反应液集中在离心管底部；扩增，设置好 PCR 仪循环程序，将装有反应液的微量离心管放入 PCR 仪进行扩增。