师：同学们，今天我们复习高中人教版生物学选择性必修三第三章基因工程的基本操作程序。以转基因抗病玉米为例回顾该程序。现有某品系玉米不抗病，香蕉的NPR1基因是植物抗病信号传导的关键基因，该基因在植物中过量表达可促使植物内源水杨酸含量升高，诱导植物过敏性反应和系统获得抗病性，达到广谱抗病目的。科学家拟将NPR1基因作为目的基因培育抗病玉米新品种。那么，如何利用香蕉的NPR1抗病基因培育转基因抗病玉米呢？
首先从抗病香蕉中提取NPR1抗病基因，然后将该基因与载体拼接，得到重组DNA分子。再将重组DNA分子导入普通玉米的体细胞或卵，经过植物组织培养后得到植株，若检测出其能够表达NPR1抗病基因，并表现出抗病特性，即可鉴定其为转基因抗病玉米。
总结起来，培育转基因抗病玉米主要需要四个步骤：一、目的基因的筛选与获取；二、基因表达载体的构建；三、将目的基因导入受体细胞；四、目的基因的检测与鉴定。
第一步，目的基因的筛选与获取。在基因工程的设计和操作中，用于改变受体细胞性状或获得预期表达产物等的基因就是目的基因。根据不同需要，目的基因不同，主要指编码蛋白质的基因，如与生物抗逆性、优良品质生产、药物、毒物降解和工业用酶等相关的基因。
那么如何筛选目的基因呢？在浩瀚的基因海洋中找到所需目的基因往往不易，从相关的已知结构和功能清晰的基因中筛选是较为有效的方法之一。比如通过序列数据库Genbank和序列比对工具Blat，可以掌握香蕉NPR1基因的核苷酸序列，并深入了解该基因的表达产物。现在越来越多基因的结构和功能为人们所知，为科学家找到合适目的基因提供了更多机会和可能。明确目的基因后，该怎么获得它呢？第一，人工合成目的基因；第二，通过构建基因文库来获取目的基因；第三，现在最常用的利用PCR来获取和扩增目的基因。
PCR的中文全称是聚合酶链式反应。它是根据DNA半保留复制的原理，在体外如PCR仪提供参与DNA复制的各种组份与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。在提取香蕉的NPR1抗病基因时得到的DNA含量往往较低，利用PCR技术就可以在短时间内大量扩增这个目的基因。
根据体内DNA复制所需的基本条件，穆里斯等人发明的PCR反应需要在PCR扩增仪内加一定的缓冲溶液，由于DNA聚合酶需要镁离子激活，所以一般要添加镁离子、含目的基因的DNA母链，提供DNA复制的模板，高温代替解旋酶打开DNA双链，dNTP（四种脱氧核苷酸三磷酸）作为合成DNA子链的原料并提供能量。由于反应需要高温环境，所以用耐高温的DNA聚合酶来催化合成DNA子链。又由于DNA双链是反向平行的，所以需要两种引物使DNA聚合酶能够从引物的3’端开始连接脱氧核苷酸。
把PCR所需的各种组份放到PCR扩增仪中，开启NPR1抗病基因的PCR扩增过程。一、变性，当温度超过90摄氏度时，氢键断开，含NPR1抗病基因的双链DNA解聚为单链；二、复性，当温度下降到50摄氏度左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合；三、延伸，当温度上升到72摄氏度左右时，溶液中的4种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。注意，这里复制和延伸都是从子链的5’端向3’端进行。延伸后得到的产物又可以作为下一个循环的模板，如此重复循环多次，因而每一次循环后的目的基因NPR1抗病基因的量可以增加一倍，即呈指数形式扩增，经过n次扩增循环后得到2?个DNA片段。PCR产物常采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定。
下面做一个对点练习，请准备好纸笔。设计引物是PCR技术关键步骤之一，某同学设计的两组引物只标注了部分碱基序列都不合理，如下图，请分别说明理由。
答案：第一组，引物一和引物2局部发生碱基互补配对而失效；第二组，引物1’自身内部部分碱基发生互补配对而失效。
由此我们可以总结出引物的要求：一、引物自身不能环化或折叠；二、两种引物之间不能互补配对；三、引物长度不宜过短，防止引物随机结合。
获取了足够量的NPR1抗病基因后，能否直接将其导入受体细胞玉米细胞呢？答案是不行，可能很快就被玉米细胞水解掉。
为了使NPR1抗病基因在受体细胞中稳定存在并且遗传给下一代，同时使NPR1抗病基因能够表达和发挥作用，这就需要构建基因表达载体，这是培育转基因抗病玉米的核心步骤。pMXB10 - NPR1基因表达载体除了需要目的基因NPR1基因以外，还需要复制原点作为DNA复制的起始位点，保证NPR1基因可以遗传给下一代；启动子位于基因的上游，是RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动NPR1基因转录出mRNA；终止子位于基因的下游，终止NPR1基因的转录。所以目的基因的插入位点不是随意的，必须插入到启动子与终止子之间。标记基因一般是抗生素抗性基因或荧光蛋白基因，用来鉴别或筛选含重组DNA分子的细胞。
在构建抗病玉米的基因表达载体时，首先会用一定的限制酶切割载体，使它出现一个切口，露出粘性末端。然后用同种或产生相同末端的限制酶切割含有NPR1基因的DNA片段，再利用DNA连接酶将NPR1基因片段拼接到载体的切口处，这样就形成了一个重组DNA分子，由此基因表达载体构建完成。
接下来思考几个问题。第一题，使用一种限制酶进行切割是否只会得到目的基因与载体结合的这一种重组DNA？根据图示思考，目的基因能否自连，质粒能否自连，目的基因与质粒能否反向连接？答案是都能。由于使用一种限制酶进行切割，所以目的基因和质粒产生的4个粘性末端都是相同的。我们发现目的基因和质粒分别可以自连，质粒与质粒之间可以连接，目的基因与目的基因之间也可以连接，目的基因与质粒连接时既可以正向连接，也可以反向连接。单酶切缺点主要是质粒、目的基因自身环化，质粒与目的基因反向连接。
如何防止目的基因和质粒的自身环化以及目的基因的反向连接呢？尝试用EcoRⅠ限制酶和BglⅡ限制酶切割载体和目的基因并将其连接。我们发现选择两种不同的限制酶同时对目的基因和载体切割，可以使目的基因两侧和载体上各自具有两种不同的粘性末端，从而防止目的基因和载体的自身环化和反向连接。